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YuanStem 20多能干細胞培養(yǎng)基使用說明書
*本文中YuanStem 20，簡寫成YS20。
1. 準備工作
A. 配置YS 20完全培養(yǎng)基
1.1 將YS20 10x Supplement提前一天取出置于2℃-8℃條件下解凍。
1.2 用無菌移液管將50ml 10x Supplement與450ml YS20 Basal Medium混合均勻，成為YS20完全培養(yǎng)基（以下簡稱YS20完全培養(yǎng)基）。
* YS20完全培養(yǎng)基可在2℃-8℃避光條件下保存1月，使用前預熱至室溫。
B. 使用Matrigel或VTN包被孔板
1.3a Matrigel包被孔板：按照使用品牌的說明書操作進行孔板包被，以0.1ml/cm2的用量(1ml/六孔板1孔)將Matrigel稀釋液加入TC處理的培養(yǎng)容器中，晃動容器使其覆蓋全部表面，37℃培養(yǎng)箱中包被一小時以上。
*包被好的孔板可以封口后在2-8℃保存，2周內(nèi)使用。
1.3b VTN包被孔板：按照使用品牌的說明書操作進行孔板包被，推薦使用10ug/ml濃度進行包被，培養(yǎng)箱（37℃）靜置至少2小時后使用。
2. 使用YS20培養(yǎng)基復蘇細胞
2.1 YS20復蘇/傳代培養(yǎng)基配制：室溫預熱YS20完全培養(yǎng)基，根據(jù)所用凋亡抑制劑（如Y27632等）推薦濃度加入適當體積的凋亡抑制劑，配置YS20復蘇/傳代培養(yǎng)基。
*Y27632推薦濃度為5-10uM。
2.2 吸棄包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN，每孔加入2ml YS20復蘇/傳代培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中平衡pH和溫度。
2.3 將細胞從液氮罐中取出，置于干冰上，轉移至細胞房內(nèi)。手持凍存管置于37℃水浴鍋或細胞復蘇儀中解凍，凍存管內(nèi)*剩小片冰晶時，用70%酒精表面消毒。
2.4 將凍存管內(nèi)的細胞轉移至含有9ml DMEM/F12或YS20完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，輕輕吹打，200 g 離心 3 分鐘，吸棄上清，用1-2ml YS20復蘇/傳代培養(yǎng)基重懸。
*使用DMEM/F12或YS20完全培養(yǎng)基潤洗凍存管內(nèi)側以盡可能多地收集細胞。
2.5 以合適的密度將重懸后的細胞接種至步驟2.2準備的六孔板中，在37℃培養(yǎng)箱中以十字法搖晃均勻，24h后更換為YS20完全培養(yǎng)基。
*復蘇時通常以50萬細胞/孔或更高密度接種,正常情況下6小時內(nèi)絕大部分細胞都可以完成貼壁。
3. 以單細胞形態(tài)進行傳代和凍存
*當細胞融合度達到80-90%時，可以進行傳代。
3.1 室溫預熱YS20完全培養(yǎng)基、PBS（不含鈣、鎂，下同）、TrypLE Express消化液和Matrigel/VTN包被的六孔板，并配置YS20復蘇/傳代培養(yǎng)基（步驟2.1）。
3.2 吸棄包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN，每孔加入2ml YS20復蘇/傳代培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中平衡pH和溫度。
3.3 從培養(yǎng)箱中取出細胞，吸棄培液。每孔加入1ml PBS，輕柔晃動孔板以潤洗表面一次，吸棄。每孔加入1ml TrypLE Express，置于37℃培養(yǎng)箱中消化3-5分鐘。
*觀察到細胞有明顯脫壁跡象（細胞團邊緣明顯變亮，但其主體部分仍未脫壁）時即可進行下一步操作。
3.4 每孔加入1ml YS20完全培養(yǎng)基，用移液器輕柔吹打3-4次，將所有細胞懸液收集到含有9ml DMEM/F12或YS20完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，200 g 離心 3 分鐘，吸棄上清，用1-2ml YS20復蘇/傳代培養(yǎng)基重懸后計數(shù)。
3.5 以合適的密度將重懸后的細胞接種至步驟3.2準備的六孔板中，在37℃培養(yǎng)箱中以十字法搖晃均勻，24h后更換為YS20完全培養(yǎng)基。
*傳代擴增每個孔接種密度為10-30萬細胞，其他分化實驗根據(jù)需求密度接種；接種后剩余的細胞如果需要保留，可以離心去上清后以2×106/ml的密度凍存。
4. 以細胞團形態(tài)進行傳代和凍存
*將PSC消化成細胞團形態(tài)進行傳代和凍存對細胞造成的壓力較小，適合不需要精確控制細胞接種數(shù)量的場景，如日常留種傳代。
4.1 室溫預熱YS20完全培養(yǎng)基、PBS、0.5mM EDTA和Matrigel/VTN包被的六孔板。
4.2 吸棄包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN，每孔加入2ml YS20完全培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中平衡pH和溫度。
4.3 從培養(yǎng)箱中取出細胞，吸棄培液。每孔加入1ml PBS，輕柔晃動孔板以潤洗表面一次，吸棄。每孔加入1ml 0.5mM EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化5-8分鐘。
*顯微鏡下觀察，細胞團邊緣明顯變亮、有脫壁跡象時即可終止消化。
4.4 用移液器輕柔吹打3-4次使細胞團從六孔板表面脫落，并形成較為均勻的細胞懸液，將所有細胞懸液收集到含有9ml DMEM/F12或YS20完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，200 g 離心 3 分鐘，吸棄上清，用1-2ml YS20完全培養(yǎng)基重懸。
*如果細胞的貼壁力度較強，也可使用細胞刮刀輔助傳代。
4.5 根據(jù)后續(xù)實驗計劃，在步驟4.2準備的六孔板中以1:5-1:20的比例接種細胞團，在37℃培養(yǎng)箱中以十字法搖晃均勻，24h后更換新的YS20完全培養(yǎng)基。
*接種后剩余的細胞如需保留，可以離心去上清后以估算的100萬/管的密度凍存。
5. YS20多能干細胞培養(yǎng)基的傳代/換液方案
YuanStem 20多能干細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品如下——
上海倍篤生物科技有限公司，致力于為細胞&基因zhiliao、抗體藥、mNGS病原檢測&RNase抑制、干細胞及外泌體等領域，提供高質量、合規(guī)試劑原料。目前，倍篤生物是ArcticZymes Technologies、MBL、Tonbo、Leinco、Nordmark、SEQURNA、邁銳生物、再帆生物等品牌的中國區(qū)代理。
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