宿主細胞蛋白殘留檢測抗體覆蓋率評估實驗操作復雜，需要在建立實驗方法階段對關鍵步驟進行充分的驗證，以證明實驗方法的穩(wěn)健性。湖州申科開發(fā)的基于磁珠捕獲的IMBS方法（immunomagnetic beads separation），在開發(fā)過程中對關鍵步驟進行了充分驗證,相關結果經(jīng)過專業(yè)評審，驗證的內(nèi)容如下（部分）：①方法優(yōu)化：針對磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關鍵參數(shù)進行優(yōu)化驗證，以保證方法的穩(wěn)健性；②過程質(zhì)控：二維電泳存在實驗步驟多，時間跨度長，中間步驟難以控制等缺陷，因此在等電聚焦實驗部分設計了熒光標記多肽，可快速判斷等電聚焦效果。在SDS-PAGE電泳的兩側增加40 ng銀染質(zhì)控，用于銀染顯色的控制；③方法重復性：針對2D分析以及LC-MS分析進行重復性確認，其中2D分析方法重復性可達到80%以上，LC-MS分析方法可到90%以上；④上樣量優(yōu)化：針對2D分析以及LC-MS分析進行上樣量確認，消除上樣量差異對檢測結果帶來的影響；⑤假陽性：排除樣品與陰性抗體之間是否存在非特異性結合，確定IMBS實驗所設定的步驟、參數(shù)是否有假陽性結果存在。

宿主細胞蛋白殘留檢測抗體覆蓋率評估：法規(guī)推薦的方法有兩大類：一類是傳統(tǒng)2D-WB法，另一類是基于抗體親和的免疫捕獲類方法。傳統(tǒng)2D-WB法存在需要蛋白變性，樣品需要前處理（破壞蛋白天然表位）；轉(zhuǎn)膜效率低；易產(chǎn)生非特異性等缺陷，難以反映真實的覆蓋率水平。湖州申科自主開發(fā)了免疫磁珠捕獲分離技術（immunomagnetic beads separation，IMBS)，利用免疫磁珠的半液態(tài)性質(zhì)，可以在懸浮的條件下與HCP樣本充分混勻結合，整個過程蛋白無需變性，結合方式與ELISA檢測條件相似，可以獲得更真實的覆蓋率結果。

影響宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測結果的因素之一是操作規(guī)范。一方面，實驗人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗對檢測結果的準確性有很大影響。熟練的實驗人員能夠準確地進行樣品處理、試劑配制和儀器操作，減少人為誤差。另一方面，一個合理的HCP檢測方法，在開發(fā)及應用時，應當考慮操作的合理變動區(qū)間（即耐用性）并設置相質(zhì)控，從程序上盡量消除人為誤差對結果的影響。此外，嚴格遵循標準操作流程（SOP）是確保檢測結果可靠性的關鍵。操作步驟的不規(guī)范可能導致結果的重復性差或誤差增大。目前，湖州申科已正式推出全自動化HCP ELISA檢測系統(tǒng)，可以完成從樣品制備、孵育、洗板至數(shù)據(jù)采集等一系列操作，結合實驗室信息管理系統(tǒng)（LIMS），可以實現(xiàn)“輸入即輸出”，減少流程誤差。

宿主細胞蛋白來源中往往同時存在核酸，胞膜脂類，培養(yǎng)基中的氨基酸等非HCP成分會干擾總蛋白的檢測準確性，需要在檢測之前進行純化前處理，同時對總蛋白檢測方法進行方法學確認。HCP是一種多蛋白質(zhì)的混合物，總蛋白定量方法之間檢測結果會存在一定程度的差異，這也是導致HCP免疫檢測方法結果差異的原因之一。若HCP蛋白定量方法間檢測結果差異較大，一般同時采用2種以上經(jīng)過確認的方法檢測，再取均值?？偟鞍讬z測方法的定量限一般只能達到μg/mL水平,但是HCP檢測試劑盒的產(chǎn)品校準品在ng/mL水平。從HCP高濃度原液稀釋到低濃度產(chǎn)品校準品中存在稀釋誤差，需要對產(chǎn)品校準品進行重新標定賦值。

湖州申科生物推出的宿主細胞殘留蛋白檢測全自動 ELISA 分析系統(tǒng)，整合了標曲制備、樣本加樣、恒溫孵育、板孔清洗及結果檢測等全流程功能。系統(tǒng)搭載的高精度前處理模塊與檢測模塊，通準確控制實驗參數(shù)，有效減少人為操作誤差，確保實驗結果的穩(wěn)定性與準確性。其多模塊單獨運行設計，可實現(xiàn)不同檢測任務的并行處理，大幅縮短實驗周期，明顯提升整體實驗效率。在保障結果可靠的基礎上，該系統(tǒng)實現(xiàn)了 ELISA 實驗的自動化操作、標準化流程與快速化輸出，降低了對實驗人員的技能要求，同時通過優(yōu)化資源配置減少檢測成本。此外，系統(tǒng)內(nèi)置完善的數(shù)據(jù)管理功能，可滿足實驗數(shù)據(jù)完整性記錄與全流程審計追蹤需求，嚴格符合 21 CFR Part 11 法規(guī)要求，并配備三級權限管理機制，進一步保障實驗數(shù)據(jù)的安全性與規(guī)范性。

畢赤酵母（Pichia pastoris）是第二代酵母表達系統(tǒng)中的代表性菌株，是美國FDA認定的GRAS（Generally Recognized As Safe）微生物，具有表達水平高，產(chǎn)物活性好，培養(yǎng)成本低，易擴大為工業(yè)化生產(chǎn)等特點。在生物制藥領域，酶制劑、胰島素、表皮生長因子、膠原蛋白等多種生物制劑已經(jīng)通過畢赤酵母系統(tǒng)進行商業(yè)化生產(chǎn)。與其他產(chǎn)品雜質(zhì)一樣，畢赤酵母宿主殘留蛋白（HCP）可能對生物制品的安全性和有效性產(chǎn)生不利影響，因此在生產(chǎn)監(jiān)測、產(chǎn)品放行等過程中需要對其進行定量研究并進行嚴格控制。SHENTEK^®畢赤酵母HCP殘留檢測試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）是湖州申科生物自主研發(fā)、具有完全自主知識產(chǎn)權的、實現(xiàn)關鍵試劑全國產(chǎn)化的畢赤酵母HCP通用檢測試劑盒。本試劑盒適用于基于GS115、X33等在內(nèi)的畢赤酵母菌株生產(chǎn)的生物制品中宿主殘留蛋白的定量檢測，操作步驟少、快速，檢測專一性強，性能穩(wěn)定可靠。