LC-MS/MS 作為一種成熟可靠的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)，憑借其超高的分辨率與準確度在生物分析領(lǐng)域占據(jù)重要地位。該技術(shù)不僅能實現(xiàn)對低含量宿主細胞殘留蛋白（HCP）的定性檢測，還可通過建立專屬蛋白質(zhì)譜庫準確鑒定 HCP 的具體種類，為深入解析殘留蛋白組成提供關(guān)鍵支撐。不過，其應(yīng)用過程中面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于，如何優(yōu)化 LC-MS 方法以滿足 GMP 規(guī)范中對產(chǎn)品放行檢測的嚴格要求。在質(zhì)譜檢測環(huán)節(jié)，通過引入表征清晰的內(nèi)標與外標蛋白，能夠準確分析 HCPs 的整體組成，并有效鑒別其中具有潛在風險的高風險蛋白。這一技術(shù)手段不僅為開發(fā)產(chǎn)品專屬的 HCP ELISA 檢測方法提供有力數(shù)據(jù)支持，還能助力工藝優(yōu)化升級，加速推動生物制品從研發(fā)到獲批上市的全流程進程。

湖州申科采用免疫磁珠分離（IMBS）結(jié)合 2D 電泳或者 LC-MS 的方法評估抗體覆蓋率。IMBS主要流程包括多克隆抗體與磁珠偶聯(lián)，磁珠未結(jié)合位點的封閉，HCP樣本與結(jié)合抗體的磁珠共同孵育，此過程中 HCP 抗體結(jié)合可以識別的 HCP，而未識別的 HCP 則通過后續(xù)洗滌步驟去除，再通過低 pH等洗脫條件收集抗體捕獲的HCP。該方法擁有 AAE(Antibody Affinity Extraction)免疫層析柱分離的所有優(yōu)點，同時免疫磁珠可以在懸浮的條件下與 HCP樣品充分混勻結(jié)合，HCP結(jié)合效果更佳，由于采用磁珠吸附可以減少 HCP與填料的非特異性吸附，提高實驗準確性。

LC-MS技術(shù)作為生物制品宿主細胞蛋白殘留檢測新趨勢，需考慮以下幾點：①穩(wěn)定性：需要HCPs LC-MS檢測流程進行驗證，全流程都需要有嚴格的QC控制，確保檢測結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性。②可重復(fù)性：不同類型生物制品中HCPs提取效率不同，不同人員操作存在差異，需要在上機前通過不同方法評估HCPs的提取效率，避免人為因素造成結(jié)果重復(fù)性差。③準確度：方法開發(fā)與驗證階段，通過設(shè)立內(nèi)標與定量算法，根據(jù)內(nèi)標響應(yīng)回算得到HCPs的含量，確保定量結(jié)果的準確性。④抗干擾能力：高豐度蛋白和特殊基質(zhì)會對質(zhì)譜檢測產(chǎn)生影響，需要通過前處理手段對高豐度蛋白或特殊的基質(zhì)進行去除，以減少其對HCPs肽段在質(zhì)譜檢測時的影響。⑤真實性：樣品中除HCPs以外的物質(zhì)在質(zhì)譜分析中同樣會產(chǎn)生質(zhì)譜信號，需要去除復(fù)雜的背景噪音避免假陽性和假陰性的出現(xiàn)，建立合理標準的生信分析流程。分析流程建立過程中同樣需要建立嚴格的質(zhì)控QC標準，并通過后期不同方法進行驗證，確定其標準的真實性。

磷脂酶B樣蛋白2（Phospholipase B-Like 2，PLBL2/PLBD2），因其強共純化能力、強免疫原性和潛在的酶活性，被認為是CHO HCP的關(guān)鍵高風險因子之一。目前行業(yè)建議，需要開發(fā)特定的檢測方法對這些已知蛋白或特定蛋白進行監(jiān)控以更好地把控其潛在風險。SHENTEK^® CHO PLBL-2殘留檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）是湖州申科生物自主研發(fā)的、具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的CHO PLBL-2蛋白通用檢測試劑盒。本試劑盒適用于基于CHO表達系統(tǒng)的生物制品中CHO HCP高風險蛋白PLBL-2的定量檢測。本試劑盒操作步驟少，快速，檢測專一性強，性能穩(wěn)定可靠。

對于HCP抗體的純化方法，目前美國藥典1132章節(jié)推薦有兩種方式，包括protein A或protein G親和柱層析法和HCP抗原親和柱層析法。兩種方法各有優(yōu)缺點，均符合監(jiān)管的要求。在實際使用過程中，這對不同產(chǎn)品可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異。兩者方法得到的抗體主要區(qū)別是HCP抗體有效含量的占比。HCP抗原親和柱層析法顯然占比高，但是也存在某些HCP抗體丟失的情況，這也會導(dǎo)致針對某些樣本的檢測結(jié)果比前者偏低，需要企業(yè)在實際方法建立時進行充分的評估。HCP抗原親和柱層析法對純化工藝要求更高，為保證抗體批間一致性，需要重點考察HCP抗原柱制備工藝、柱子的使用壽命、再制備的一致性等問題。

影響宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測結(jié)果的因素之一是操作規(guī)范。一方面，實驗人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗對檢測結(jié)果的準確性有很大影響。熟練的實驗人員能夠準確地進行樣品處理、試劑配制和儀器操作，減少人為誤差。另一方面，一個合理的HCP檢測方法，在開發(fā)及應(yīng)用時，應(yīng)當考慮操作的合理變動區(qū)間（即耐用性）并設(shè)置相質(zhì)控，從程序上盡量消除人為誤差對結(jié)果的影響。此外，嚴格遵循標準操作流程（SOP）是確保檢測結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。操作步驟的不規(guī)范可能導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性差或誤差增大。目前，湖州申科已正式推出全自動化HCP ELISA檢測系統(tǒng)，可以完成從樣品制備、孵育、洗板至數(shù)據(jù)采集等一系列操作，結(jié)合實驗室信息管理系統(tǒng)（LIMS），可以實現(xiàn)“輸入即輸出”，減少流程誤差。