無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（CFPS）根據(jù)反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)可分為分批式（Batch）、雙層式（Bilayer）和連續(xù)交換式（CECF）三種主要形式。分批式是Zui基礎(chǔ)的形式，反應(yīng)在單一試管中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單但受限于底物耗盡和副產(chǎn)物積累，表達(dá)時(shí)間通常只4小時(shí)，適合小規(guī)模篩選（如Promega的試劑盒）。雙層式通過(guò)密度差異將反應(yīng)液與緩沖液分層，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至8-20小時(shí)，日本CFS公司的產(chǎn)品采用此設(shè)計(jì)。連續(xù)交換式（CECF）通過(guò)半透膜連接反應(yīng)室與供應(yīng)室，持續(xù)補(bǔ)充底物并移除副產(chǎn)物，可將反應(yīng)延長(zhǎng)至24小時(shí)，產(chǎn)量明顯提高（如德國(guó)RTS系統(tǒng)的1mL及以上規(guī)模產(chǎn)品）在冰上預(yù)混裂解物與能量混合物，是保證??體外蛋白表達(dá)??重復(fù)性的關(guān)鍵步驟。大分子蛋白表達(dá)流程

凋亡因子（如caspase-3）、細(xì)菌du su（如白喉du suA鏈）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)會(huì)引發(fā)宿主死亡。體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)無(wú)細(xì)胞環(huán)境規(guī)避毒性效應(yīng)：在添加線(xiàn)粒體膜組分的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中，全長(zhǎng)BAX蛋白（21kDa）表達(dá)量達(dá)0.8mg/mL，并成功模擬其介導(dǎo)的細(xì)胞色素C釋放過(guò)程（CellDeathDiffer.,2024）。該系統(tǒng)還可表達(dá)HIV蛋白酶（活性>95%），用于高通量抑制劑篩選，加速抗病毒藥物開(kāi)發(fā)。真he dan白的糖基化修飾（如抗體Fc段N-糖）是zhi liao性蛋白功能的he xin。傳統(tǒng)體外蛋白表達(dá)因缺乏高爾基體，糖基化效率不足5%。突破性方案是在HEK293裂解物中添加重組糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（含GnT-I、GnT-II、FUT8），使曲妥珠單抗的復(fù)雜雙觸角糖型比例升至80%（Science,2022）。結(jié)合UDP-GlcNAc底物連續(xù)補(bǔ)料，糖均一性（G0F:G2F=1:1.2）媲美哺乳細(xì)胞表達(dá)，為下一代抗體偶聯(lián)藥物（ADC）提供新生產(chǎn)路徑。gst融合蛋白表達(dá)優(yōu)化例如HIV蛋白酶在通過(guò)體外蛋白表達(dá)后仍切割底物蛋白，但其毒性被限制在封閉體系內(nèi)。

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（CFPS）的雛形可追溯至20世紀(jì)50年代。1958年，Zamecnik頭次證明細(xì)胞裂解物中的翻譯機(jī)器可在體外合成蛋白質(zhì)，為技術(shù)奠定基礎(chǔ)。1961年，Nirenberg和Matthaei利用大腸桿菌裂解物破譯遺傳密碼子，推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展。然而，早期技術(shù)因表達(dá)量低、穩(wěn)定性差，長(zhǎng)期局限于實(shí)驗(yàn)室研究，主要用于密碼子解析和翻譯機(jī)制探索，未實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用。近十年，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)技術(shù)加速向醫(yī)療、合成生物學(xué)等領(lǐng)域滲透。例如，在COVID-19期間，該技術(shù)被用于快速生產(chǎn)疫苗抗原和抗體。同時(shí)，AI算法的引入實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)條件智能預(yù)測(cè)，進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)效率。中國(guó)企業(yè)如蘇州珀羅汀生物通過(guò)自主研發(fā)試劑盒，推動(dòng)國(guó)產(chǎn)化替代。未來(lái)，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)或與代謝工程、微流控技術(shù)結(jié)合，成為生物制造和準(zhǔn)確醫(yī)療的he xin工具。

20世紀(jì)90年代后，隨著分子生物學(xué)和合成生物學(xué)的進(jìn)步，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)技術(shù)迎來(lái)突破。研究者通過(guò)優(yōu)化裂解物制備（如敲除大腸桿菌核酸酶）、開(kāi)發(fā)能量再生系統(tǒng)（如Phosphoenolpyruvic acid，PEP循環(huán)），明顯提升蛋白產(chǎn)量和反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)。2000年代初，連續(xù)交換式反應(yīng)體系（CECF）的出現(xiàn)解決了底物耗盡問(wèn)題，使反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至24小時(shí)以上，產(chǎn)量達(dá)毫克級(jí)，為工業(yè)化鋪平道路。此階段，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于毒性蛋白合成和抗體片段生產(chǎn)，但成本仍較高。添加 0.1% Triton X-100 使疏水蛋白的體外表達(dá)可溶率達(dá)90%??。

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，體外蛋白表達(dá)技術(shù)主要服務(wù)于三大方向：診斷試劑開(kāi)發(fā)： 通過(guò)凍干裂解物與靶標(biāo)基因預(yù)裝系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)傳染xing bing原體抗原的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)合成與檢測(cè)；蛋白質(zhì)工程優(yōu)化： 構(gòu)建突變體文庫(kù)并并行表達(dá)篩選，快速獲得熱穩(wěn)定性/催化效率提升的酶變體；藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證： 表達(dá)跨膜受體等復(fù)雜蛋白，用于配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)及抑制劑高通量篩選；合成生物學(xué)元件構(gòu)建： 作為人工合成細(xì)胞的he xin模塊，驅(qū)動(dòng)無(wú)細(xì)胞基因回路實(shí)現(xiàn)自我維持的蛋白表達(dá)。該技術(shù)明顯加速了從基因序列到功能蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)化周期。兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物??含??成熟血紅蛋白合成機(jī)制??，能準(zhǔn)確折疊多結(jié)構(gòu)域蛋白。功能蛋白表達(dá)的局限

芯片級(jí)體外蛋白表達(dá)??體現(xiàn)較前沿的進(jìn)展。大分子蛋白表達(dá)流程

體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)的本質(zhì)是利用 純化的細(xì)胞裂解物（含核糖體、tRNA、翻譯因子及能量再生組分）重構(gòu)蛋白質(zhì)合成機(jī)器。在A(yíng)TP/GTP供能條件下，核糖體通過(guò)mRNA模板介導(dǎo)的密碼子-反密碼子配對(duì)，驅(qū)動(dòng)氨基酸按序列聚合成肽鏈。該過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)包括：翻譯起始效率（受5'UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)及Shine-Dalgarno序列影響）、延伸速率（依賴(lài)EF-Tu/G因子濃度）和終止準(zhǔn)確性（釋放因子RF1/2活性）。體外蛋白表達(dá)的高效性源于其 去除了細(xì)胞膜屏障，使反應(yīng)底物濃度可人為提升至生理水平的10-100倍，大幅加速肽鏈合成動(dòng)力學(xué)。大分子蛋白表達(dá)流程